Metagenomi: метагеномика на службе биотехнологий

Главное

Биотехнологический стартап «Метаджиноми» (Metagenomi) собирается привлечь до 100 млн долларов в ходе первичного размещений акций (IPO).

«Метаджиноми», основанная в начале 2018 года, разрабатывает лекарственную терапию на базе обширного инструментария метагеномного редактирования генома.

Ранее «Метаджиноми» удалось привлечь 457 млн долларов венчурного капитала.

Метагеномика представляет собой раздел молекулярной генетики, изучающий генетический материал, полученный непосредственно из образцов окружающей среды или клинических образцов методом секвенирования. Метагеномика изучает набор генов всех микроорганизмов, находящихся в образце среды, — метагеном. Эту широкую область также можно назвать геномикой окружающей среды, экогеномикой, геномикой сообществ или микробиомикой.

Благодаря своей способности выявлять ранее скрытое разнообразие микроскопической жизни, метагеномика предлагает мощный способ понимания мира микроорганизмов, который может произвести революцию в понимании биологии.

 

Теория

«Метаджиноми» (Metagenomi) поставила на метагеномику, преследуя масштабную цель разобраться с четырьмя миллиардами лет эволюции микроорганизмов, чтобы обнаружить и разработать набор новых инструментов редактирования, способных исправить любой тип генетической мутации, обнаруженной в любом месте генома человека.

«Метаджиноми» проанализировала свыше 460 трлн пар оснований и предсказала более 7,4 млрд белков, включая 1,75 млн коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR), и 322 млн CRISPR-ассоциированных (CAS) белков, что, судя по оценкам, привело к идентификации свыше 20 тыс. новых систем редактирования генома. Одновременно собраны обширные библиотеки из миллионов нуклеаз, дезаминаз, обратных транскриптаз, и CRISPR-ассоциированных транспозаз (CAST).

В распоряжении «Метаджиноми» находится комплексный набор инструментов для редактирования генома, включающий программируемые нуклеазы, редакторы оснований, опосредованные РНК и ДНК системы интеграции, в том числе системы прайм-редактирования и CAST.

Разнообразный и модульный инструментарий в арсенале «Метаджиноми» позволяет получить доступ ко всему геному и выбрать оптимальный инструмент для раскрытия всего потенциала его редактирования в случае конкретной болезни.

Программируемые нуклеазы. Тысячи CRISPR-нуклеаз помогают выбрать идеальную систему для сайт-специфического нацеливания на любую генетическую мишень с преодолением основного ограничения систем CRISPR первого поколения. Для модификации генома программируемые нуклеазы создают целевые геномные разрывы, запускающие пути репарации ДНК. Это позволяет интегрировать ген в целевой участок (нокин) или деактивировать ген (нокдаун).

Ультрамалые нуклеазы способны снять ограничения по размеру доставляемой полезной нагрузки in vivo, характерные для нуклеаз первого поколения. Они в несколько раз меньше по размеру и легко упаковываются в один аденовирусный вектор (AVV), по эффективности доставки обходя традиционные липидные наночастицы (LNP).

Редакторы оснований, будучи самыми маленькими из известных CRISPR-редакторов оснований, ориентированы на однонуклеотидные изменения и совместимы с различными технологиями доставки, в том числе AVV.

РНК-опосредованные интеграционные системы (RIGS) осуществляют программируемые геномные модификации, закодированные в матричных РНК (мРНК). Платформа RIGS позволяет вносить в геном как небольшие правки (прайм-редактирование), так большие, включая вставки, делеции и все типы точечных мутаций.

CRISPR-ассоциированные транспозазы (CAST) для сложных генных интеграций. Направленная интеграция ДНК во многом считается конечной целью корректирующего редактирования генома. Технология пригодна для лечения комплексных генетических заболеваний, вызванных мутациями с потерей функции, когда для устранения всех мутаций потребовались бы вставки размером более 10 тыс. пар оснований.

Все экспериментальные наработки «Метаджиноми» находятся на доклинической стадии. Но это помешало предприятию получить поддержку со стороны таких грандов отрасли, как «Байер» (Bayer), «Модерна» (Moderna), «Ново Нордиск» (Novo Nordisk), «Айонис фармасьютикалс» (Ionis Pharmaceuticals).

Среди широкого спектра заболеваний, на лечение которых направлена экспертиза «Метаджиноми»: гемофилия A, боковой амиотрофический склероз, мышечная дистрофия Дюшенна, муковисцидоз, сердечно-сосудистые нарушения, онкопатологии, аутоиммунные состояния.

 

Практика

Уместно рассмотреть несколько практических внедрений «Метаджиноми» (Metagenomi), которые позволяют объективно судить об уровне ее биотехнологической экспертизы в области метагеномики.

 

MG29-1

Нуклеаза spCas9, входящая в состав CRISPR-систем типа II, является основой для многих инструментов редактирования генов. «Метаджиноми» открыла MG29-1 — новую нуклеазу типа V, происходящую из бактериального генома, найденного в глубоководном гидротермальном источнике. MG29-1 располагает более высоким уровнем специфичности и уникальными последовательностями мотивов, примыкающих к протоспейсеру (PAM), что позволяет ей получать доступ к целевым участкам генома, до которых Cas9 добраться не в состоянии.

Продемонстрирована высокая эффективность, с которой MG29-1 редактирует гены в первичных клетках человека in vitro, а также у мышей и нечеловеческих приматов. Доклинически подтверждены безопасность и эффективность терапевтического нокдауна генов. Скрининг in silicon и расщепление in vitro не выявили внецелевых действий MG29-1.

 

Ультрамалые нуклеазы

Доставка полезной нагрузки в ходе редактирования генома зачастую ограничена емкостью средства доставки. Вот почему необходимы новые нуклеазы, которые значительно меньше существующих систем.

Длина популярных систем CRISPR-Cas9 типа II, производных Streptococcus pyogenes (SpCas9), — приблизительно 1300 аминокислот, тогда как длина некоторых новых нуклеаз, открытых «Метаджиноми», — чуть более 450 аминокислот. Подобная компактность несет ряд неоспоримых преимуществ для доставки, производства и дозирования. Их можно доставлять в органы и ткани, в настоящее время доступные только посредством аденовирусных векторов (AAV). Потенциально открываются показания, выходящие за рамки доставки в печень.

«Метаджиноми» назвала такие нуклеазы, включая Cas типа II и V, SMART-нуклеазами (small arginine-rich systems, малые аргинин-насыщенные системы).

 

Муковисцидоз

Одной из проблем разработки прецезионного лечения муковисцидоза является большой размер гена муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) и разнообразные мутации в нем, которые приводят к снижению экспрессии белка, потере функции, неправильному фолдингу и некорректной локализации в клетке.

Нынешние терапевтические усилия требуют индивидуальных подходов, адаптированных к определенным CFTR-мутациям. Несмотря на то что ряд таких одобренных препаратов — «Трикафта» / «Кафтрио» (Trikafta / Kaftrio, элексакафтор + тезакафтор + ивакафтор, ивакафтор), «Симдеко» / «Симкеви» (Symdeko / Symkevi, тезакафтор + ивакафтор, ивакафтор), «Оркамби» (Orkambi, лумакафтор + ивакафтор) и «Калидеко» (Kalydeco, ивакафтор) — улучшают функциональные показатели легких, не все пациенты имеют мутации, поддающиеся CFTR-таргетированию. Ни одно из существующих лекарств не дает истинного излечения от мутации CFTR-гена, лежащего в основе заболевания, и пациенты продолжают страдать от заболеваемости и смертности в результате прогрессирования муковисцидоза.

«Метаджиноми» поставила перед собой цель полного излечения муковисцидоза, одномоментного и подходящего большинству пациентов. Предполагается, что этого можно достичь путем интеграции функциональной версии гена CFTR в геном базальных стволовых клеток легких (бронхиолоальвеолярных стволовых клеток). Редактирование стволовых клеток, являющихся источником постоянного обновления дифференцированных клеток, гарантирует, что внедренный функциональный CFTR-ген не будет со временем потерян из-за отмирания дифференцированных эпителиальных клеток — места экспрессии CFTR, дефектного при муковисцидозе.

Технология Big RIGS и система CAST располагают должным потенциалом для интеграции больших фрагментов ДНК (в данном случае кодирующих ген CFTR) в определенный участок генома. При использовании Big RIGS ген CFTR доставляется в виде РНК, которая подвергается обратной транскрипции в ДНК, чтобы предоставить матрицу ДНК для интеграции. В случае с CAST ген CFTR доставляется в виде двухцепочечной ДНК, которая распознается системой CAST и интегрируется в нужный участок под действием транспозазы. Теоретически доставка в базальные стволовые клетки легких может быть осуществлена путем внутривенного введения, в том числе невирусного.

Преимущество системы Big RIGS состоит в том, что для ее доставки можно использовать только РНК, упакованных в хорошо изученные липидные наночастицы (LNP). Доставка ДНК, необходимая для системы CAST и обращающаяся к невирусным векторам, изучена не слишком, и основным ее препятствием является транзит ДНК в ядро. Впрочем, «Метаджиноми» уже продемонстрировала доставку двуцепочечной ДНК размером 4,6 килобаз в ядра клеток печени мышей с помощью внутривенного введения LNP.

 

Гемофилия A

Появление генно-терапевтического лечения тяжелой гемофилии A в лице препарата «Роктавиан» (Roctavian, валоктокоген роксапарвовек) предоставило шанс на избавление от утомительного бремени пожизненного лечения. Аденовирусный вектор (AAV) доставляет в организм трансген фактора свертывания крови VIII (FVIII), запускающий эндогенную выработку последнего, который при гемофилии A недостаточно активен или дисфункционален в коагуляционном каскаде.

После трансдукции клеток печени трансген FVIII находится в эписомальном состоянии (то есть не интегрирован в геном), где он транскрибируется, начиная с искусственно созданного экзогенного промотора, для производства матричной РНК (мРНК) FVIII, которая транслируется в белок FVIII. Такой подход к генной терапии привлекателен тем, что печень постоянно вырабатывает белок FVIII. Тем не менее уровень последнего со временем падает. Повторное введение валоктокогена роксапарвовека (valoctocogene roxaparvovec) невозможно из-за выработки высоких титров нейтрализующих антител к AAV. Данная генная терапия не подходит для лечения младенцев или детей по причине высокой скорости роста печени в ходе взросления, что приведет к «вымыванию» эписомального трансгена FVIII во время последовательных раундов деления клеток печени. Кроме того, отмечается сайленсинг эписомальной экспрессии FVIII по причине синтетической природы его промотора.

«Метаджиноми» — вместо размещения FVIII в высокорисковой эписомальной локации — предложила вставлять кассету с ДНК трансгена FVIII в «безопасное место» — в интрон гена альбумина; дальнейшая экспрессия FVIII происходит под действием сильного нативного промотора альбумина.

Согласно доклиническим исследованиям другого фактора свертывания крови (фактора IX), подход привел к терапевтически значимой экспрессии с незначительным влиянием на системный уровень циркулирующего альбумина.

Была продемонстрирована осуществимость нокин-подхода к гену FVIII на мышах и нечеловеческих приматах с использованием нескольких различных донорских кассет ДНК FVIII, при этом интеграция гена FVIII обеспечила экспрессию мРНК FVIII и терапевтически значимый уровень белка FVIII в крови.

Программа редактирования генома при гемофилии A состоит из двух компонентов: липосомальных наночастиц (LNP), которые доставляют мРНК вместе с гидовой РНК (гРНК) в печень для производства высокоэффективной и специфической нуклеазы, осуществляющей точный разрез в локусе «безопасной гавани» гена альбумина, и аденовирусных векторов (AAV) для доставки донорской матричной ДНК FVIII, которая вставляется в место разреза нуклеазы в результате естественного процесса восстановления ДНК — негомологичного соединения концов.

 

Сердечно-сосудистые заболевания

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смерти во всём мире. И хотя ССЗ не являются генетически обусловленными болезнями, существуют хорошо проверенные гены-мишени и сигнальные пути, таргетирование на которые позволяет создать соответствующее мощное лекарство на базе генного редактирования.

Среди наиболее важных сигнальных путей, оказывающих заметную клиническую пользу как при гипертонии, так и при хронической сердечной недостаточности, следует отметить ренин-ангиотензин-альдостероновую систему (РААС), на которую успешно воздействует ряд важных лекарственных препаратов, включая ингибиторы ренина, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, блокаторы рецепторов ангиотензина и антагонисты альдостерона. Пероральные ингибиторы РААС, благотворно влияющие на артериальное давление, полезны также при ишемической болезни сердца (ИБС), диабетической нефропатии и других формах хронической почечной недостаточности. Однако постоянное 24-часовое ингибирование сигнального РААС-пути оказывается не всегда успешным.

Согласно ряду исследований, в качестве лекарственной РААС-мишени для подавления имеет смысл выбрать вырабатываемый печенью ангиотензиноген (AGT). Подход позиционируется безопасным для снижения артериального давления без особых рисков гипотонии, гипокалиемии или острого поражения почек.

«Метаджиноми» собирается осуществить нокдаун экспрессии AGT с помощью программируемых нуклеаз, чтобы добиться стойкого снижения артериального давления, причем после однократного лечения, то есть навсегда.

На гуманизированных мышиных моделях с несколькими копиями человеческого гена AGT, интегрированными в случайные участки генома, было продемонстрировано, что введение экспериментальных препаратов привело к снижению уровней мРНК и белка AGT на 85–91% и 92–93% соответственно.

 

Боковой амиотрофический склероз

Основная причина бокового амиотрофического склероза (БАС) по-прежнему остается неизвестной. Тем не менее распространенной гистопатологической находкой являются неправильные агрегаты цитоплазматических белков, которые включают TDP-43. Поскольку TDP-43 представляет собой высококонсервативный ядерный РНК- и ДНК-связывающий белок, участвующий в процессинге РНК, клинические проявления БАС могут быть обусловлены как токсичными цитоплазматическими агрегатами TDP-43, так и нарушениями процессинга РНК в результате утраты у TDP-43 нормальных ядерных функций.

Прямое воздействие на TDP-43 не представляется возможным из-за его критической роли в процессинге РНК и других клеточных функциях. Вот почему «Метаджиноми» намерена разработать терапию, направленную на нокдаун гена ATXN2, который кодирует атаксин-2 — белок, являющийся мощным генетическим модификатором TDP-43.